Unidad de Proteómica

 

Datos de contacto:

Manuel Marcos - Paula Álvarez Chaver

986 130 129 - 986 813 884

Este enderezo de correo está a ser protexido dos robots de correo lixo. Precisa activar o JavaScript para velo.

 

A Unidade de Proteómica ofrece servizo para o estudo de proteínas aos investigadores da Universidade de Vigo e de outras institucións, tanto públicas como privadas. A proteómica defínese como o estudo do proteoma (conxunto de proteínas expresado polo xenoma completo dunha célula ou un tecido nun momento determinado, baixo precisas e determinadas condicións), mediante métodos bioquímicos de separación de proteínas a gran escala, co fin de obter una visión global e integrada dos procesos celulares.

 

O espectro de estudo da proteómica divídese en catro grandes áreas: proteómica de expresión, proteómica de expresión diferencial, proteómica de interaccións, estructural ou de mapa celular e a modificómica, que se centra na análise das modificacións post-traduccionais. Na Unidade de Proteómica realízase tanto a identificación de proteínas como a análise de expresión diferencial, seguindo tres aproximacións metodolóxicas:

 

1. Cuantificación relativa do nivel de expresión de proteínas mediante análise de imaxe de xeles:

  • Separación de proteínas mediante electroforese monodimensional en xeles de poliacrilamida, en condicións nativas (NATIVE-PAGE) ou desnaturalizantes (SDS-PAGE).
  • Separación de proteínas mediante electroforese bidimensional (2-DE), na que a separación en xeles SDS-PAGE é precedida por un fraccionamiento baseado no punto isoeléctrico (isoelectroenfoque, IEF).
  • Revelado de imaxe mediante tinción colorimétrica (Azul de Coomassie, Nitrato de Plata) ou fluorescencia (Sypro, Oriol, etc).
  • Adquisición, alineamento e análise de imaxes.

 

2. Identificación de proteínas mediante dixestión encimática seguida da análise por espectrometría de masas e a búsqueda en base de datos:

  • Análise de pegada peptídica (MALDI-MS) e de espectros de fragmentación de péptidos (MALDI-MS/MS). Utilízase para identificar proteínas purificadas, bandas de xeles SDS-PAGE e manchas proteicas de xeles 2-DE.
  • Separación de péptidos por cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS/MS). Utilízase para identificar proteínas en mostras de complexidade moderada/alta, en termos de número de proteínas.

 

3. Identificación e cuantificación relativa do nivel de expresión de proteínas mediante análise por espectrometría de masas LC-MS/MS:

  • Marcaxe isobárico (iTRAQ e TMT). Permite a comparación de ata 10 mostras nun único análise de LC-MS/MS.
  • Sen marcaxe (Label-free).

 

Equipamento instrumental

1. Equipo de Cuantificación de Proteína Direct DetectTM (Merck Millipore).

Espectrómetro baseado en infravermellos (IR) que mide as ligazóns amida.

 

2. Equipos de Electroforese (Bio-Rad):

2.1 Protean IEF System.

Sistema de separación de proteínas en función do punto isoeléctrico en tiras de 7, 10 ou 17 cm de lonxitude.

2.2 Mini-PROTEAN Tetra Cell.

Sistema de separación de proteínas en función da súa masa molecular relativa en minixeles de 7 cm x 8 cm x 0.75 mm.

2.3 Protean II XL.

Sistema de separación de proteínas en función da súa masa molecular relativa en xeles de 19.5 cm x 18.4 cm x 1.5 mm.

 

3. Equipo de Análise de Imaxe ChemiDoc™ XRS+ (Bio-Rad).

Cámara CCD de alta resolución e sensibilidade para a adquisición de imaxes de xeles e blots de colorimetría, fluorescencia, quimioluminiscencia, etc.

 

4. Equipo de Análise de Imaxe PharosFX™ Plus (Bio-Rad).

Múltiples láseres con diversas aplicacións: bromuro de etidio, SYPRO Ruby, Deep Purple, Alexa Fluor 488, 532, 546, y 635, Cy2, Cy3, Cy5, Pro-Q Diamond, etc.

 

5. Equipo de Cromatografía Líquida FPLC ÄKTApurifier 10 (GE Healthcare).

Equipo de purificación de péptidos e proteínas con colector de fraccións Frac-950, triple detector UV (190-700 nm) e bomba P-903 (10 ml/min, 250 bar, 25 MPa).

 

6. Nano-HPLC Bidimensional Dionex UltiMate 3000 (Thermo Fisher).

Inyector automático con control de temperatura. Detector UV. Sistema de formación de gradientes e desgasificado de disolventes por vacío.

 

7. Colector de Fraccións Proteineer fc (Bruker).

Para placas MALDI ou placas de pocillos. Cabina protectora.

 

8. Espectrómetro de Masas MALDI-TOF/TOF Autoflex III Smartbeam (Bruker).

Fonte MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) e analizador de tempo de voo (TOF, Time-Of-Flight). Láser de N2. Reflector de dúas etapas sen reixa para extracción pulsada de ions.

 

9. Espectrómetro de Masas FTMS APEXIII (Bruker).

Imán superconductor horizontal apantallado cun campo de 7 Teslas. Fontes de ESI (Electrospray Ionization), nanoESI e MALDI. Célula de medida de resonancia ciclotrónica de ións INFINITY.

 

10. Espectrómetro de Masas LTQ-Orbitrap ELITE (Thermo Fisher).

Sistema híbrido de espectrómetro de masas de trampa iónica-Orbitrap. Acoplado a sistema Proxeon EASY-nLC 1000 UHPLC. Elevada potencia de resolución e fragmentación mediante CID, HCD e ETD.

Aplicacións

Biomedicina: busca de biomarcadores, desenvolvemento de métodos de diagnóstico e pronóstico, identificación de proteínas diana para terapia, desenvolvemento de fármacos (anticanceríxenos, antimicrobianos, etc), desenvolvemento de vacinas, estudos de mecanismos de patoxénese, etc.

 

Bioloxía celular e bioquímica: estudo de metabolitos, toxinas, venenos, etc.

 

Ecoloxía e bioloxía evolutiva: adaptación ecolóxica, especiación, etc.

 

Tecnoloxía dos alimentos: desenvolvemento, mellora, control de calidade e seguridade alimentaria.

Requisitos das mostras

Tipos de mostra: líquido biolóxico, extracto de proteínas ou péptidos en disolución, banda ou mancha proteica, ou un xel. O servizo non acepta mostras de tecido biolóxico ou células xa que non dispón do equipamento necesario para a extracción de proteínas.

 

Cuantificación de proteína co equipo Direct DetectTM: recomendable para mostras de entre 0.25 e 5mg/mL de proteína. Necesario un volume mínimo de 2µL. Non compatible con concentracións altas de tampón bicarbonato, EDTA, GndCl, HEPES, NaOH, Tris, Urea, glicerol, SDS, Tween, etc. Necesario facilitar ao servizo o tampón da mostra para utilizar como branco.

 

SDS-PAGE: a mostra debe ter unha concentración aproximada de entre 1 e 10 µg/µL.

 

2D-PAGE: realizar unha limpeza do extracto proteico para eliminar os sales da mostra e dos tampóns empregados na súa preparación (PBS, RIPA, HEPES, etc). A presenza de sales é crítica pola súa interferencia co isoelectroenfoque (IEF). O límite de concentración total de ións que pode ter a mostra é 40mM. O SDS é incompatible co IEF debido ao seu carácter iónico. O extracto final debe entregarse en tampón de electroforese ou liofilizado. A cantidade de proteína recomendable para un xel analítico (50-200µg) é menor que para un xel preparativo (500µg-1.5mg).

 

Corte e dixestión enzimática: recortar a banda ou mancha proteica cun bisturí limpo, evitando zonas de xel non tinguido e mesturas de proteínas. Realizar toda a preparación con guantes e nunha cabina de fluxo laminar para evitar a contaminación con queratinas, que se atopan no pelo, na pel e na roupa, xa que dificultan a identificación das proteínas de interese.

 

Análise MALDI-MS/MS: evitar a presenza de sales, deterxentes iónicos (SDS) e non iónicos (Triton X-100, Tween, etc), disolventes non volátiles (glicerol, PEG, β-mercaptoetanol, DMSO e DMF), caotrópicos (Urea, GndCl) e outros contaminantes que dificulten a cristalización da mostra coa matriz, a desorción ou a ionización. Non interfiren o TFA, ácidos fórmico e acético, HCl, DTT, NH4OH e os disolventes orgánicos volátiles.

 

Análise LC-MS/MS: utilizar reactivos de grao de pureza para HPLC. A cantidade de mostra dependerá do tipo de análise requerido (consultar co persoal do servizo). Se a mostra ten urea, sales ou outros posibles interferentes (SDS, PEG, glicerol, TFA, etc) é imprescindible realizar unha limpeza exhaustiva da mostra (ZipTip ou equivalente).

Web desarrollada por Linckia