Xenómica

 

Datos de contacto:

Ángel Sebastián Comesaña - Verónica Outeiriño Iglesias

+34 986818613

Este enderezo de correo está a ser protexido dos robots de correo lixo. Precisa activar o JavaScript para velo.

 

A Unidade de Xenómica ten coma obxectivo dar servizo en diferentes metodoloxías experimentais para o estudo do DNA e RNA aos investigadores da Universidade de Vigo e de outros centros e institucións públicos e privados. A unidade de Xenómica ofrece aos investigadores diferentes técnicas de estudo do xenoma. Por un lado a Unidade ofrece a secuenciación de DNA e RNA, tanto polo método de Sanger coa posterior electroforese capilar no analizador xenético como a secuenciación masiva dos mesmos (NGS) empregando a tecnoloxía de semiconductores en chips de Ion Torrent. Para estas metodoloxías, nesta unidade realizase todo o proceso experimental (reacción de secuenciación e posterior purificación e análise, así como a preparación das librerías NGS e a súa secuenciación). Por outro lado na unidade cóntase con equipamento para PCR en tempo real convencional e de PCR dixital (dPCR).

 

Con este equipamento os investigadores poden facer cuantificacións absolutas e relativas (expresión xénica) de DNA e RNA e detectar variantes xénicas en moi baixa proporción (alelos raros). Tanto para os procesos internos coma para os usuarios externos, nesta unidade cóntase tamén con equipamento destinado ao control de cantidade e calidade do material xenético. Ademais de espectrofotómetro e fluorímetro, disponse dun bioanalizador que permite, mediante electroforese capilar en chip, o cálculo da integridade do RNA (RIN) e a cuantificación de librerías para NGS.

 

Na Unidade de Xenómica, ademais do traballo experimental anteriormente descrito, o persoal técnico tamén presta asesoramento aos investigadores e usuarios sobre a aplicación das devanditas técnicas instrumentais ós seus proxectos e liñas de investigación.

 

Equipamento instrumental

SECUENCIADOR CAPILAR ABI 3130

O analizador xenético do que dispón este servicio é un Applied Biosystems 3130. Este equipo ten 4 capilares e nel pódense levar a cabo as seguintes aplicacións: secuenciación de novo e resecuenciación (perfil de mutacións), análise de microsatélites, AFLP, LOH, detección de SNPs e "SNPs screening".


SECUENCIADORES DE NOVA XENERACIÓN (NGS)

O secuenciadores Ion torrent dispoñibles no servizo son o Ion Personal Genome Machine (Ion PGM) é o Ion Proton System Dependendo do tipo de chip utilizado podemos secuenciar dende 400-500 mil lecturas ata 4,5-5 millóns

 

TERMOCICLADOR 7900 HT FAST REAL-TIME PCR

Este equipo permite a amplificación por PCR de fragmentos de DNA e a súa monitorización a tempo real co emprego de sondas fluorescentes (sondas TaqMan) ou fluorocromos intercalantes (SYBR GREEN).

 

QuantStudioTM 3D DIGITAL PCR SYSTEM

En este equipo a PCR realizase nun chip que contén 20000 pocillos (Digital PCR Chip v2), onde se carga a mostra e os reactivos fluorescentes (métodos baseados en sondas TaqMan® ou SYBR GREEN™). Posteriormente, os ciclos da PCR realízanse empregando o equipo ProFlex ™ 2x Flat PCR System.

 

BIOANALIZADOR 2100 DE AGILENT TECHNOLOGIES

Este equipo permite cuantificar, integrar e comprobar a calidade de preparacións de DNA,

 

NANODROP ND-1000

É un espectrofotómetro (rango de 220 a 750 nm) que mide en volumes de mostra de 1 a 2 microlitros.

 

FLUORÍMETRO QUBIT 2.0

É un fluorímetro que permite mediante a utilización de sondas fluorescentes, cuantificar de forma altamente específica mostras de DNA e RNA nun rango de volume entre 1 a 10 microlitros

Aplicacións

  • Secuenciación de rexións xénicas (amplicóns, plásmidos)
  • Análise de fragmentos de DNA (microsatélites, STRs, VNTRs, etc)
  • Análise de mutacións puntuais e polimorfismos
  • Secuenciación de novo (xenomas pequenos) e resecuenciación
  • Secuenciación de exomas, transcriptomas e RNA de pequeno tamaño
  • Metaxenómica
  • Secuenciación de paneis de xenes diana ou a demanda (AmpliSeq DNA/RNA)
  • Secuenciación con paneis deseñados de DNA circulante (cfDNA, paneis OncoMine)
  • Expresión e cuantificación xénica
  • Discriminación alélica mediante sondas TaqMan
  • Discriminación alélica por disociación de alta resolution (HRM)
  • Detección de alelos raros e cuantificación sen patróns (dPCR)
  • Cuantificación espectrofotométrica e fluorométrica de ácidos nucleicos
  • Control de calidade e cantidade de DNA e RNA (cálculo do RIN)

Requisitos das mostras

Os usuarios deben presentar na solicitude un documento co número e nome das mostras a analizar. Ademais dito documento indicará a natureza das mostras (DNA ou RNA) e toda a información da que se dispoña: tamaño dos amplicóns, tamaño dos insertos en plásmidos, concentración da mostra se se sabe, solvente no que están disoltas, purificadas con ExoSap ou non, etc. Cada mostra debe estar perfectamente identificada co seu nome (que preferiblemente deberá ser un número).

 

O volumen e concentración da mostra dependerá da aplicación a realizar. Para cuantificación necesitarase un volumen mínimo de 5 µL (incluido o Bioanalizador). Para secuenciación de Sanger necesítanse entre 100 e 300 ng, polo que o volumen da mostra estará en función da súa concentración. O recomendable serían entre 10 e 15 µL de mostra a unha concentración de 40-50 ng/µL. As mostras para migrar no secuenciador capilar deben vir xa preparadas resuspendidas en formamida con marcador de tamaños incorporado (para fragmentos) ou purificadas e resuspendidas en formamida ou auga para secuencias.

 

As mostras para secuenciación masiva serán primeiro avaliadas en cantidade e calidade. O volumen e a cantidade de DNA para NGS dependerá da aplicación, polo que en cada momento establecerase polo persoal desta unidade, previa consulta cos usuarios. Como norma indicativa, a cantidade mínima recomendada de DNA para NGS será de 40-60 ng/µL (cun volumen mínimo de 20 µL), inda que poden ser menores dependendo da aplicación. O DNA pode vir resuspendido en TE, Low TE, EB, etc, inda que se recomenda a súa resuspensión en auga. En canto a cantidade e calidade do RNA para NGS sucederá o mesmo, inda que non se secuenciarán mostras con valores de RIN menores de 6,5-7 salvo acordo previo cos usuarios. A preparación de librerías estándar para transcriptómica debe partirse dun mínimo de 100 ng, inda que o recomendable e ter un mínimo de 500 ng. O RNA debe vir resuspendido preferiblemente en auga.

 

Calquera dúbida dos usuarios sobre a calidade ou cantidade das súas mostras será consultada co persoal da unidade.

 

Web desarrollada por Linckia